通用名 非洲豬瘟病毒熒光 PCR 檢測試劑盒商品名 無(wú)

英文名 African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit

漢語(yǔ)拼音 Feizhouzhuwenbingdu Yingguang PCR Jianceshijihe

【主要成分與含量】

【作用與用途】 用于全血、血清、淋巴結、脾臟、腎臟、扁桃體、肺、肌肉、環(huán)境樣品等樣品中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。

【用法與判定】

1 用法

1.1 樣品采集及處理

1.1.1 活豬樣品 無(wú)菌采集抗凝血或血清 5 ml。

1.1.2 病死豬剖檢樣品或屠宰場(chǎng)剖檢樣品 無(wú)菌采集死豬的脾、肺、腎、扁桃體、淋巴結、肌肉等組織樣品。2～8℃低溫運至實(shí)驗室用于檢測。

1.1.3 病豬污染的周邊環(huán)境 采集與病豬相關(guān)場(chǎng)所的糞便、飼料、污水樣品。2～8℃低溫運至實(shí)驗室用于檢測。

1.2 樣品處理方法

1.2.1 脾、肺、腎等組織樣品處理方法 取適當大小的組織塊放入盛有 PBS 緩沖液的研磨管中，6000 r/min 震蕩研磨 45 秒，制成約 10%的組織勻漿液，5000 r/min 離心 5 分鐘，取200μl 上清液進(jìn)行核酸提取。

1.2.2 糞便、飼料樣品處理方法 取適量的糞便、飼料放入盛有 PBS 緩沖液的研磨管中，

6000 r/min 震蕩研磨 45 秒，制成約 10%的勻漿液，5000 r/min 離心 5 分鐘，取 200 μl 上清液進(jìn)行核算提取。

1.2.3 污水樣品處理方法 直接取 200 μl 污水進(jìn)行核酸提取。

1.3 樣品核酸提取 采用 DNA 提取試劑盒或自動(dòng)核酸提取儀提取各類(lèi)樣品中的核酸。低溫保存待檢。

1.4 PCR 擴增 將試劑盒置室溫使熒光 PCR 酶混合液、引物探針、陰性對照和陽(yáng)性對照完全溶解，并混勻。

1.4.1 將引物探針（棕色管）和熒光 PCR 酶混合液瞬時(shí)離心后，將熒光 PCR 酶混合液全部移至引物探針（棕色管）中，顛倒混勻 6 次，充分混勻，配制成 PCR 反應液。

1.4.2 取 18 μl PCR 反應液至每個(gè)反應管內，然后加 2 μl 所提取的樣品核酸，每個(gè)反應總體積為 20 μl。每次檢測應設立陽(yáng)性對照和陰性對照。在熒光 PCR 儀上進(jìn)行擴增檢測。

1.5 反應程序

37℃孵育 2 分鐘，95℃預變性 5 分鐘；95℃變性 15 秒，58℃退火延伸 1 分鐘，45 個(gè)循環(huán)， 在每一循環(huán)的 58℃時(shí)收集 FAM 熒光信號。

2 結果判定

2.1 陽(yáng)性對照的 Ct 值應＜35 且出現特異性擴增曲線(xiàn)，陰性對照應無(wú) Ct 值或 Ct 值≥40 且無(wú)特異性擴增曲線(xiàn)，試驗結果有效；否則應重新進(jìn)行試驗。

2.2 被檢樣品 Ct 值＜40 且出現特異性擴增曲線(xiàn)，判為陽(yáng)性；當無(wú) Ct 值或 Ct 值≥40， 判為陰性。

【注意事項】 （1） PCR 檢測的每一步都應在專(zhuān)門(mén)區域或地點(diǎn)進(jìn)行。

（2） 使用前應將熒光 PCR 酶混合液、引物探針、陰性對照和陽(yáng)性對照完全溶化，充分振蕩混勻，瞬時(shí)離心，盡量吸取液體上層。

（3） 試劑盒不同組分間不得交叉，防止污染。

（4） 避免反復凍融。

（5） PCR 產(chǎn)物均應合理處理，以免造成污染。

（6） 嚴格按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

（7） 按要求貯藏，冷鏈運輸；并在有效期內使用。

【規格】 50 次/盒

【貯藏與有效期】 -20℃以下保存，有效期為 15 個(gè)月。

僅供獸醫診斷使用