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檢測原理

試劑盒采用雙抗一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被傷寒抗體的包被微孔中，依次加入標本、HRP標記的檢測抗原，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度（OD 值），與CUTOFF值相比較，從而判定標本中傷寒抗原（St-Ag）的存在與否。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。

3.  細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1. 酶標儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

操作注意事項

1.  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì )有結晶，這屬于正?，F象，水浴加熱使結晶完全溶解后再使用。

2.  實(shí)驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.  預處理后的樣本無(wú)需稀釋?zhuān)苯尤?/span>50μL加樣即可。

4.  嚴格按照說(shuō)明書(shū)中標明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.  所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

試劑的準備

 20×洗滌緩沖液的稀釋?zhuān)赫麴s水按1：20稀釋?zhuān)?份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩盡孔內液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min后甩盡孔內液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.  自動(dòng)洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設置陰、陽(yáng)性對照孔和樣本孔，陰、陽(yáng)性對照孔中加入陰性對照、陽(yáng)性對照各50μL；

3.  待測樣本孔加待測樣本10μl，樣本稀釋液40μL；

4. 隨后陰、陽(yáng)性對照孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）

1.標記的檢測抗原100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

2.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

3.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

4.  每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長(cháng)處測定各孔的OD值。

結果判斷

 1.  試驗有效性：陽(yáng)性對照孔OD值平均值≥1.00；

                陰性對照孔OD值平均值≤0.15。

2.  臨界值（Cut off）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

3.  陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off），樣品為陰性

4.  陽(yáng)性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off），樣品為陽(yáng)性

試劑盒性能

1.  準確性：陽(yáng)性對照孔OD值平均值≥1.00；陰性對照孔OD值平均值≤0.15，說(shuō)明試驗結果有效。

2.  特異性：不與其它可溶性結構類(lèi)似物交叉反應。

3.  重復性：板內、板間變異系數均小于15%。

4.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

5.  有效期：6個(gè)月